4.蘇木素：水化后，組織切片用蘇木素染色1-~3min，可根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整染色時間。蘇木素是一種基本染料，可以對細(xì)胞的酸性成分進(jìn)行染色，包括核酸、粘多糖、酸性糖蛋白，將他們?nèi)境伤{(lán)色或藍(lán)紫色。注：沒有蘇木素，伊紅會將組織染成亮粉紅色；顯而易見的是缺乏細(xì)胞核。組織結(jié)構(gòu)很難區(qū)分，細(xì)胞內(nèi)成分幾乎都不存在，難以辨別。針對上述問題，可以使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染。

(1) 染色較弱是由于：自身溶解或者固定不好；過度脫鈣；染色時間不足；過度脫色（酸與醇的比例過高或者酸乙醇脫色時間過長）；蘇木素的作用較弱（蘇木素氧化過度（過老）或水稀釋過度）；漂洗溶液的污染；切片過薄；乙醇的去除或者染色前水的漂洗不充分。

(2) 染色過度是由于：組織切片干燥；蘇木素濃度過高；染色時間過長；載玻片粘合劑過多；脫色過弱或時間不足；切片過厚；熱暴露的時間過長。

5.水洗：蘇木素染色后，用水洗組織是非常重要的。這一步以及隨后的水洗，可將多余的染料，媒染劑等去除。適當(dāng)?shù)钠纯梢匀コ砻娼饘俟鉂桑饘俟鉂煽勺柚固K木素的染色。注：跳過此步，將產(chǎn)生不好的結(jié)果，例如沉淀的形成，染液的稀釋，表面金屬光澤的存在。

6.酸酒精：酸酒精分色劑3-5s。在蘇木素染色方法中，組織切片有意過度染色，酸酒精將去除多余的染料以及玻片上的背景染色。

注：若省略此步驟，切片將呈暗紫色，嗜酸性結(jié)構(gòu)（如膠原）不會顯現(xiàn)出明亮的粉紅色，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)之間難以區(qū)分，從而影響對切片的準(zhǔn)確判斷。另外，分色過度可能是由于：酸濃度過高；脫色時間過長等。分色不足是由于：酸濃度過低；脫色時間不足；在切片上有多余的蛋白或者明膠等。

7.水洗：水洗30s，終止酸酒精反應(yīng)，進(jìn)一步阻止酸酒精從組織切片上將大量蘇木素去除。注：如果切片沒有經(jīng)過漂洗，酸酒精可以過度脫色。如果不去除脫色劑，酸酒精將持續(xù)從組織切片上去除蘇木素。

8.自來水沖洗或用藍(lán)化液藍(lán)化：自來水沖洗3-5min，可起到發(fā)藍(lán)處理，將紫紅色的蘇木素轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)紫色。通常，發(fā)藍(lán)試劑是pH依賴性的，由堿性溶液構(gòu)成。因此，如果自來水作為發(fā)藍(lán)試劑，pH值的每天監(jiān)控是非常重要的，因為自來水的pH值可能每天都會波動。或用藍(lán)化液藍(lán)化，30s-1min；流動的自來水沖洗5min；注：跳過發(fā)藍(lán)試劑步驟，將會導(dǎo)致蘇木素染液的顏色發(fā)生微妙的變化，難以區(qū)分。代替深藍(lán)色，細(xì)胞核將呈現(xiàn)紫色，有時甚至是紅色。細(xì)胞核不可過度藍(lán)染。如果組織染色過藍(lán)，一般是在組織切片上蘇木素過多所致。

9.水洗：為伊紅復(fù)染做準(zhǔn)備，通過水洗30sec，將多余的發(fā)藍(lán)試劑去除。因為在堿性環(huán)境下，伊紅無法染色，水洗去除發(fā)藍(lán)試劑將允許伊紅保持其酸性pH值，使伊紅得以均勻復(fù)染。注：發(fā)藍(lán)試劑之后，如果沒有水洗，組織切片無法正確使用伊紅染色。因此，酸性結(jié)構(gòu)將被染為蒼白色并且不均勻，進(jìn)而導(dǎo)致錯誤的判斷。

10.伊紅：為了正確區(qū)分胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，伊紅是出色的蘇木素復(fù)染劑。伊紅復(fù)染30-60s，可根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整染色時間。伊紅是酸性染料，可染細(xì)胞質(zhì)，尤其是線粒體、分泌顆粒和膠原。它可以區(qū)分細(xì)胞內(nèi)不同的細(xì)胞器以及不同的結(jié)締組織。注：使用伊紅復(fù)染組織切片的失敗，將導(dǎo)致組織切片的低分化。

(1) 染色較弱是由于：組織切片過薄；染色時間不足；隨后95%酒精分化過度。

(2) 染色過度是由于：染液濃度較高（可能是由于過度蒸發(fā)）；組織切片過厚；染色時間過長；隨后95%酒精分化不足。

(3) 伊紅染色未分化（一種顏色）是由于：固定不徹的底；過度染色（染色時間過長或染液濃度過高）。

11.95%乙醇：95%乙醇處理2s-1min，根據(jù)染色結(jié)果和要求調(diào)整；伊紅分化將產(chǎn)生不同的粉色。注：如果95%乙醇被稀釋（例如，從前一步染色中攜帶了伊紅），分化的效果較差。

12.100%乙醇：通過100%乙醇使組織切片脫色。100%乙醇處理1min；再用新的100%乙醇處理1min。注：這一步很難引起注意，若無95%乙醇，難以區(qū)分酸性結(jié)構(gòu)，組織切片成為粉色。若無100%乙醇脫水，組織切片不能脫水，導(dǎo)致在蓋片下形成水珠。這些水珠可與下一步的二甲苯結(jié)合而形成白色混濁物，這將影響組織切片的質(zhì)量。

13.二甲苯：二甲苯處理5min。在充分脫水后，二甲苯可將組織切片上的酒精去除。去除酒精后，在載玻片上加蓋玻片時，二甲苯也可作為包埋劑確保可溶解。由于有潛在的毒性，二甲苯替代品，例如檸檬烯、環(huán)烷烴也可使用。替代品可提供相同的組織染色質(zhì)量，并且他們使用更安全，操作更簡單。注：當(dāng)跳過此步驟時，不使用二甲苯透明，酒精將會保存于組織切片上，導(dǎo)致伊紅從切片上流出。

14.封片：中性樹膠封片，自然風(fēng)干或烤干，顯微鏡觀察。

染色結(jié)果：細(xì)胞核染為藍(lán)色；細(xì)胞質(zhì)染為紅色。

注意事項

1．本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2．為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

3．試劑應(yīng)保存于陰涼、干燥、通風(fēng)良好的環(huán)境中。

4．第一次使用本試劑盒時建議先取1-2個樣品做預(yù)實驗。

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